液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題與解答
1何謂反相柱、正相柱？
答：“反相”和“正相”的概念是液相色譜法早期提出的概念，當(dāng)時(shí)鍵合相色譜柱尚未出現(xiàn)，固定相被涂覆在載體表面，極易流失，為此科學(xué)家對(duì)流動(dòng)相使用給出了合理的建議：流動(dòng)相極性與固定液極性應(yīng)具有較大差別，以減少固定液流失。固定相極性弱于流動(dòng)相時(shí)的液相色譜法被稱(chēng)為反相色譜法，固定相極性強(qiáng)于流動(dòng)相時(shí)的液相色譜法被稱(chēng)為正相色譜法。盡管目前鍵合相色譜柱已成為主流，但這一概念在色譜方法開(kāi)發(fā)、預(yù)測(cè)出峰順序等方面具有重要意義。
由上面的介紹可知具體的色譜方法、色譜柱屬于正相還是反相不僅取決于固定相極性，同時(shí)還取決于流動(dòng)相極性。C18(硅膠鍵合十八烷基硅烷)、C8(硅膠鍵合辛基硅烷)、PH(硅膠鍵合苯基硅烷)等色譜柱，由于固定相極性極低，比目前已知的任何流動(dòng)相的極性都要低，因而是標(biāo)準(zhǔn)的反相柱；Silica(硅膠)、NH2(硅膠鍵合氨丙基硅烷)具有較高的極性，主要用于分離帶有極性基團(tuán)的化合物，所用流動(dòng)相的極性通常低于這些固定相，因而是標(biāo)準(zhǔn)的正相柱。CN(硅膠鍵合腈丙基)的極性適中，當(dāng)流動(dòng)相極性超過(guò)CN時(shí)，它屬于反相柱，反之則是正相柱。
2色譜柱規(guī)格對(duì)分析結(jié)果會(huì)產(chǎn)生何種影響？
答：色譜柱內(nèi)徑?jīng)Q定載樣量，載樣量與內(nèi)徑的平方成正比；色譜柱長(zhǎng)度與塔板數(shù)成正比，與柱壓成正比；粒徑影響渦流擴(kuò)散相，粒徑越小渦流擴(kuò)散相越小，柱效越高，粒徑與柱效近似成反比；粒徑越小，壓力也越大，壓力與粒徑的平方成反比。填料孔徑對(duì)分析對(duì)象的分子量有限制，當(dāng)孔徑為分析物尺寸的5倍以上時(shí)，分析物才能順利通過(guò)孔隙，孔徑處于60~120Å的色譜柱適用于相對(duì)分子量小于10000的分析物，孔徑為300Å的色譜柱可以滿足分子量處于10000以上的大分子化合物分析。
3液相色譜分析中如何才能提高分離度？
答：下式為分離度計(jì)算公式
N：柱效(Efficiency)反映色譜柱性能，柱效越高，分離度越好。在其他條件恒定的情況下，塔板數(shù)增加一倍，分離度僅提高40%。操作中，可通過(guò)下面兩種方式增加塔板數(shù)進(jìn)而提高分離度：其一，使用長(zhǎng)柱或雙柱串聯(lián)，但也會(huì)使分離時(shí)間大大延長(zhǎng)；其二，使用細(xì)粒徑填料的色譜柱，但這需要耐更高壓力的液相色譜系統(tǒng)。相比之下后者更為可取。
α：選擇性(selectivity)是指色譜柱-流動(dòng)相體系分離兩個(gè)化合物的能力。選擇性主要與固定相、流動(dòng)相組成以及柱溫等因素有關(guān)，與保留值也密切相關(guān)，其中固定相和流動(dòng)相組成影響較大。以zui常見(jiàn)的反相模式為例，反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用對(duì)化合物進(jìn)行保留的，不同化合物的分離是基于它們?cè)阪I合相與流動(dòng)相中分配系數(shù)的差異，如果兩種化合物的水溶性、在烷烴-水體系的分配系數(shù)等方面存在明顯差異，那么這些化合物通常是能夠利用反相柱達(dá)到分離；PH柱對(duì)具有苯環(huán)的化合物具有特殊保留。正相模式下，硅膠柱、胺基柱、氰基柱與帶有極性基團(tuán)的化合物之間存在極性相互作用，對(duì)化合物的基團(tuán)具有選擇性，常常用于結(jié)構(gòu)類(lèi)似物、異構(gòu)體化合物的分離。流動(dòng)相方面，降低流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度通?？梢栽龃蠓蛛x度；而有機(jī)溶劑類(lèi)型也會(huì)影響分離，比如反相條件下，乙腈和甲醇的選擇性就存在很大差異，這種差異需要在實(shí)踐中摸索，但無(wú)論如何，多種溶劑類(lèi)型帶給我們更多的實(shí)現(xiàn)分離的可能。
k：隨著容量因子k的增大，分離度也隨之增加，這種影響在k值較低時(shí)非常明顯，當(dāng)k值大于10時(shí)，k值增加對(duì)分離度的影響就不再顯著，這就告誡無(wú)原則地提高k值以增大分離度是沒(méi)有意義的。增加鍵合相密度能夠提高k值；另外改變鍵合基團(tuán)類(lèi)型也能改變k值，比如在反相色譜中，隨著鍵合相碳鏈長(zhǎng)度的增加，k值逐漸增大。
4色譜峰的峰形是怎樣衡量的？有何規(guī)定？
理論上講，色譜峰應(yīng)符合高斯曲線分布，然而實(shí)際上任何色譜峰都對(duì)高斯曲線分布存在一定的偏離，亦即不對(duì)稱(chēng)。峰拖尾可以用不對(duì)稱(chēng)因子(As)或USP拖尾因子(Tf)來(lái)衡量，顯然不對(duì)稱(chēng)因子的說(shuō)法更準(zhǔn)確，因?yàn)樯V峰存在前延、對(duì)稱(chēng)、拖尾三種形態(tài)。一般來(lái)說(shuō)，制藥行業(yè)以USP拖尾因子作為評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而其他行業(yè)則多采用As來(lái)測(cè)定峰形。
對(duì)于藥物分析，通常有明確的規(guī)定，Tf應(yīng)處于某一范圍之間，比如我國(guó)藥典規(guī)定某些藥物的拖尾因子應(yīng)處于0.95~1.05之間。其他行業(yè)尚無(wú)較為明確的規(guī)定。
5什么是梯度洗脫？什么情況下使用梯度洗脫？
答：為了改善分析結(jié)果，某些操作需要連續(xù)改變流動(dòng)相中各溶劑組分的比例以連續(xù)改變流動(dòng)相的極性，使每個(gè)分析組分都有合適的容量因子k，并使樣品種的所有組分可在zui短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)*分離，這種洗脫方式稱(chēng)為梯度洗脫。
梯度洗脫可在下列情形中發(fā)揮重要作用：
A在等度下具有較寬k值的多種樣品分析。
B大分子樣品分析。
C樣品含有強(qiáng)保留的干擾物，在目標(biāo)化合物出峰后設(shè)置梯度洗脫，將干擾物洗脫出來(lái)，以免其影響下一次數(shù)據(jù)采集。
D分析方法建立時(shí)，不知道其洗脫情況，使用梯度洗脫，找出其較優(yōu)的洗脫條件。
6何謂封端？封端的意義是什么？
硅膠表面的硅羥基(Si-OH)密度為8μmol/m2，由于空間位阻的存在，硅烷化鍵合反應(yīng)zui多只能覆蓋50%的硅羥基，超過(guò)一半的硅羥基是活性硅羥基。這些硅羥基與化合物的極性基團(tuán)存在極性相互作用和離子交換作用，為化合物的保留增加了不被期望的作用力，往往會(huì)影響峰形。用短鏈氯硅烷（如*基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小甚至消除這種影響，這種操作被稱(chēng)為封端(Endcap)。
封端處理的意義：
抑制了特異性吸附，提高了色譜峰的對(duì)稱(chēng)性，并改善了分離效果；
在一定程度上掩蔽了硅膠表面，使其對(duì)堿性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)；
通過(guò)空間位阻掩蓋了鍵合反應(yīng)形成的Si-O-Si鍵，使其對(duì)酸性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)；
可能會(huì)影響對(duì)極性樣品的選擇性。
7柱床塌陷和鍵合相塌陷
柱床塌陷是指色譜柱使用一段時(shí)間后色譜柱入口處的柱床產(chǎn)生可見(jiàn)的空隙。該空隙的存在增大了死體積，會(huì)導(dǎo)致色譜柱柱效下降。造成柱床塌陷的原因如下：其一，色譜柱填裝時(shí)的壓力過(guò)低，填裝不緊密，在高壓下使用一段時(shí)間，開(kāi)始出現(xiàn)空隙；其二，操作壓力超出色譜柱填料的耐壓值，導(dǎo)致填料顆粒破碎產(chǎn)生空隙；其三，流動(dòng)相溶解填料導(dǎo)致空隙出現(xiàn)。鍵合相塌陷是指由于流動(dòng)相極性與鍵合相極性相差太大，鍵合相無(wú)法在流動(dòng)相中充分伸展而倒伏、纏結(jié)在一起，比如普通C18在純水相
條件下。相塌陷會(huì)導(dǎo)致色譜柱對(duì)化合物的保留不足。
8系統(tǒng)壓力升高的原因及排除
使用者通過(guò)觀察儀器的系統(tǒng)監(jiān)測(cè)掌握系統(tǒng)的壓力，如果發(fā)現(xiàn)壓力偏高，不要立即認(rèn)為“柱壓高了”，因?yàn)橄到y(tǒng)壓力通常由柱前壓力、色譜柱壓力和流通池壓力加合而成。此時(shí)正確的做法是：在操作條件下，測(cè)定系統(tǒng)壓力，得到p總；卸下色譜柱，在相同條件下，測(cè)定柱前壓力，得到p前；用兩通將泵流出管路與流通池連接，在操作條件下，測(cè)定壓力，得到p(前+后)。通過(guò)計(jì)算找出壓力高是來(lái)自柱前、色譜柱還是柱后。
以上情形假設(shè)沒(méi)有安裝保護(hù)柱，如果安裝了保護(hù)柱，壓力升高時(shí)應(yīng)先測(cè)試保護(hù)柱的壓力，以便確認(rèn)問(wèn)題是否來(lái)自保護(hù)柱。
9系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定
通常情況下，泵壓的變動(dòng)值超過(guò)了0.5Mpa，系統(tǒng)壓力就屬于不穩(wěn)定的范疇。導(dǎo)致系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定的zui直接原因?yàn)榱鲃?dòng)相流量和組成輸出的不穩(wěn)定，而導(dǎo)致流動(dòng)相輸出不穩(wěn)定的原因通常包括溶劑互容性較差、系統(tǒng)漏液、系統(tǒng)存在氣泡以及輸液系統(tǒng)部件工作失效等等。下面將介紹排除“系統(tǒng)壓力不穩(wěn)”的方法。
流動(dòng)相輸出不穩(wěn)定還會(huì)導(dǎo)致基線不穩(wěn)定以及保留時(shí)間變化等現(xiàn)象，所以基線不穩(wěn)定或保留時(shí)間不重現(xiàn)時(shí)，先看一下柱壓是否穩(wěn)定，如果不穩(wěn)定，三個(gè)問(wèn)題可以合并處理。
10基線不穩(wěn)定
基線不穩(wěn)定是指色譜曲線在較長(zhǎng)時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)響應(yīng)值的0刻度較大的偏離，通常包括基線漂移(單方向)、基線起伏(規(guī)律的上下起伏)、區(qū)域?qū)挾葮O大的色譜峰三種情況
| 問(wèn)題 | 現(xiàn)象 |
| A 基線漂移 |  |
| B 基線波動(dòng) |  |
| C 寬大色譜峰 | |
如果基線不穩(wěn)定同時(shí)伴隨壓力波動(dòng)，請(qǐng)按照“壓力不穩(wěn)定”進(jìn)行排查。如果壓力穩(wěn)定，請(qǐng)按下表中的方法進(jìn)行排查。
11噪聲升高
噪聲（baselinenoise）：由檢測(cè)器輸出與被測(cè)樣品組分無(wú)關(guān)的無(wú)規(guī)則波動(dòng)信號(hào)，在特定靈敏度下用響應(yīng)單位表示。可分為高頻噪聲和短周期噪聲兩種。對(duì)于光譜型檢測(cè)器，噪聲的正常響應(yīng)值處于0.000005V~0.00002V之間(參考Shimadzu的HPLC儀器)，高于此值，即可認(rèn)為噪聲偏高。
噪聲升高時(shí)，先按下列步驟排查流動(dòng)相問(wèn)題
12柱性能下降
柱性能下降的一個(gè)重要現(xiàn)象就是在保留時(shí)間基本不發(fā)生變化的情況下，色譜峰的區(qū)域?qū)挾让黠@增大(如下圖)。
當(dāng)遇到柱效下降，請(qǐng)按下表進(jìn)行排查和解決
13保留時(shí)間重現(xiàn)性差
當(dāng)保留時(shí)間的偏差超過(guò)2%，可以認(rèn)為保留時(shí)間的重現(xiàn)性差。對(duì)于某一個(gè)特定的分析，保留時(shí)間主要受流動(dòng)相組成、流速、溫度以及固定相影響，當(dāng)保留時(shí)間發(fā)生明顯變化時(shí)，應(yīng)從這幾方面入手。
A由流動(dòng)相造成的保留時(shí)間不穩(wěn)定
B 由固定相造成的保留時(shí)間不穩(wěn)定
14峰形不理想
理想的色譜峰遵循正態(tài)分布，應(yīng)該符合高斯曲線，是而對(duì)稱(chēng)的峰形(如圖A)；然而由于化合物性質(zhì)的特殊性、色譜柱故障、操作條件等問(wèn)題存在，峰形可能會(huì)不對(duì)稱(chēng)，前延(B)或拖尾(C)。
| 問(wèn)題 | 現(xiàn)象 |
| A 正常峰形 | .bmp) |
| B 峰前延 |  |
| C 峰拖尾 | 
|
峰形前延(B)
中藥成分分析項(xiàng)目中，提取溶劑通常為乙醇、甲醇、乙酸乙酯等洗脫強(qiáng)度較強(qiáng)的溶劑，此時(shí)易發(fā)生“樣品溶劑的洗脫強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)流動(dòng)相”的情況，為避免前延峰出現(xiàn)，可以用通過(guò)“流動(dòng)相稀釋提取液”或降低“進(jìn)樣體積”的方式。
峰形拖尾(C)
15鬼峰
鬼峰(Ghostpeak)：是對(duì)未知來(lái)源的色譜峰的統(tǒng)稱(chēng)。
16氣泡峰
氣泡峰是指攜帶氣泡的流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器時(shí)得到的響應(yīng)值；這里的氣泡可能是流動(dòng)相中釋放的空氣，也可能是有機(jī)相遇水放熱而會(huì)釋放的有機(jī)溶劑分子；氣泡峰往往具有較高的響應(yīng)值，區(qū)域?qū)挾葍H為數(shù)秒，出峰時(shí)間和相應(yīng)值比較有規(guī)律(如下圖)。通常只有光譜型檢測(cè)器才會(huì)出氣泡峰。
解決辦法：
脫氣
使用多元梯度時(shí)，對(duì)每一種組分進(jìn)行脫氣，排除它們?nèi)芙獾目諝猓?/font>
對(duì)于預(yù)先混合的溶劑，混合后脫氣，排除溶解的空氣和因放熱而揮發(fā)出的有機(jī)溶劑分子；
前面的脫氣方式對(duì)于預(yù)先混合好的混合溶劑，基本可以達(dá)到消除氣泡峰的目的；但對(duì)于多種純?nèi)軇┰趦x器中混合的情況，混合后溶劑體系放熱，存在潛在的氣泡，當(dāng)流動(dòng)相流出色譜柱時(shí)，壓強(qiáng)驟減，潛在的氣泡溢出，被檢測(cè)器檢測(cè)到。為了防止這一問(wèn)題出現(xiàn)，應(yīng)在檢測(cè)器出口連接一段內(nèi)徑較細(xì)的管路，使流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，環(huán)境壓強(qiáng)較高，氣泡難以溢出，可以避免氣泡峰出現(xiàn)。
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